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September 2019

AUTOMATISCHE BESTIMMUNG VON 17 21-DIHYDROXY-20-KETOSTEROIDEN IM URIN ENTWICKLUNG EINES AUTOANALYZERS

Abstract: Aus dem Institut für Medizinische Balneologie und Klimatologie der Universität München Vorstand: Prof. Dr. H. Drexel Inaugural Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde in der gesamten Medizin verfaßt und einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ludwig Maximilians-Universität zu München vorgelegt von Hans Jürgen Maurer München 1974 ZUSAMMENFASSUNG 1 Zur Auswertung von Klimakammerversuchen des Institute für Medizinische Balneologie und Klimatologie sollte ein Auto-Analyzer zur Bestimmung von Cortison und Cortisol im Urin entwickelt werden. In der vorliegenden Arbeit werden nach einer kurzen Einführung in die kolorimetrische Bestimmung von Steroidhormonen (verwendet wird die PORTER/SILBER Reaktion) und in die Technik des AutoAnalyzers die bei der Entwicklung gemachten Erfahrungen geschildert und ein (inzwischen praktisch eingesetzter) Prototyp vorgestellt. 2 Die wichtigsten Entwicklungserfahrungen: 2.1 Da die Methode drei Extraktionsschritte enthält ist auch eine dreimalige Phasentrennung (Entsegmentierung) erforderlich. Bei der Trennung von Urin bzw. Natronlauge und Chloroform gab es zunächst Probleme weil die Chloroformsegmente im Phasentrenner nicht zusammenfließen wollten. Die Trennung von Chloroform und Schwefelsäure wurde durch hohe Viskosität der Säure und geringe Dichteunterschiede zwischen den Phasen erschwert. In allen Fällen erwies sich die Einfügung eines kleinen Teflonstreifens in die gläsernen Phasentrenner als vorteilhaft. In den beiden ersten Fällen wirkt er durch Veränderung der Grenzflächenspannung im letzteren dient er als Leitschiene für die Chloroformsegmente. 2.2 Schwierigkeiten bereitete die Chloroform/Säure-Segmentierung auch schon vor dar Phasentrennung: Im Gegensatz zu Luftblasen stellen die Chloroformsegmente hier nur äußerst undichte "Kolben" dar (gilt nicht immer bei Wasser bildet Chloroform z.B. sehr dichte Kolben). wegen der schlechten Trennung der Säuresegmente dauert es sehr lange bis eine Probe nicht sehr durch die vorangehende Spülphase verdünnt ist bzw. wieder vollständig aus dem System ausgewaschen ist. Die Folge davon sind hoher Probenverbrauch und niedrige Probenfrequenz. Die Probenfrequenz läßt sich nicht durch höhere Fließgeschwindigkeiten steigern da mit steigender Geschwindigkeit die Auswaschcharakteristik des Systems noch schlechter wird. 2.3 Besondere Probleme ergeben sich wenn im Chloroform/ Säure-Strom Segmente mit unterschiedlicher Trennfunktion vorkommen. Am Anfang geschah dies häufig durch Gasbildung im Säuregemisch. Die hauptsächlich in dienen Zusammenhang gemachten Erfahrungen lassen sich in folgender Regel zusammenfassen: In eines segmentierten Strom sind nur gleich (un)dichte 'Kolben' beständig ('Kolben' = die die Wand nicht benetzenden Segmente). Wenn dichte und weniger dichte Kolben vorkommen finden solange Segmentzusammenflüsse statt bis alle undichten Kolben miteinander verschmolzen sind. Verschieden dichte Segmente entstehen aber nicht nur durch einen 'Eindringling' wie die Luftblase auch lokal unterschiedliche Wandeigenschaften des Rohres (bedeutsam vor allem bei der Heizspirale aus Teflon) oder Inhomogenität des Säuregemisches können die Ursache sein. 2.4 Störungen durch Luftblasen ergaben sich auch in der Küvette in der sie durch den dort herrschenden Unterdruck besonders leicht entstanden. Alle Störungen durch Gasblasen oder Inhomogenität lassen sich durch die beschriebene Art der Gemischherstellung und Sorgfältiges Entgasen des Gemisches vermeiden. 2.5 Die Luftsegmentierung für den Durchfluß durch die Heizspirale geschah zunächst durch einfache Zuführung der Luft über einen einzelnen Pumpenschlauch. In dieser Form war sie sehr unzuverlässig. Die Störungen konnten beseitigt werden durch zwei in Serie liegende Pumpenschläuche. Der erste hat dabei einen etwas größeren Durchmesser so daß der ins System führende bereits komprimierte Luft angeboten bekommt. 2.6 Der luftsegmentierte Säurestrom wird beim jetzigen Modell durch eine Teflonspirale geleitet. Bei hoher Fließgeschwindigkeit wird die Teflonoberfläche wie Glas durchgehend von der Säure benetzt. Bei niedriger Geschwindigkeit reißt die Verbindung zwischen den Säuresegmenten dagegen vollständig ab. Bei mittleren Geschwindigkeiten kommen beide Möglichkeiten nebeneinander vor. Die Luftsegmente stellen in diesen Fall verschieden dichte Kolben dar und es finden Segmentzusammenflüsse statt. 3 Betriebsdaten das Prototyps: - Zeit für eine Bestimmung einschl. Hintergrundfärbung (je 5 min - Probe und 3 min Spülung.......................................................................16 min - Durchlaufzeit.....................................................................................ca. 45 min - Probenvol. für eine Bestimmung (im Probengefäß muß aber - etwas mehr sein)......................................................................................6 ml - Chloroform für eine Bestimmung.............................................................11 8 ml - Natronlauge (0 1 A)...................................................................................4 2 ml - Reaktionsgemisch (42 Vol. % Schwefelsäure 30 Vol. % Äthanol 28 Vol. % aqua dset. 43 mg % Phenylhydrazinhydrochlorid.....................4 8 ml - Reaktionsgemisch ohne Phenylhydrazin...................................................4 8 ml 4 Reproduzierbarkeit von Standardlösungen: Variationskoeffizienten je nach Steroidkonzentration zwischen 0 5 % (bei 10 µg/ml) und 13 8 % (bei 1 µg/ml). ___MH


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