Optimierte Aufreinigung von Synovialflüssigkeit für Chlamydia trachomatis spezifische Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Journal/Book: Z Rheumatol 1998; 57 Suppl. 1: 40 (D 7). 1998;

Abstract: Abt. Rheumatologie Medizinische Hochschule Hannover; 1Klinik für Rheumatologie Nordwestdeutsches Rheumazentrum St. Josef Stift Sendenhorst Hintergrund: Die Chlamydien-induzierte Arthritis ist durch intraartikuläre Persistenz von Chlamydia trachomatis (C. tr.) in der Synovialflüssigkeit (SF) und Synovialmembran charakterisiert. Aufgrund der geringen Anzahl intraartikulärer Erreger sind hochsensitive Nachweisverfahren zur Diagnosestellung erforderlich. Kürzlich haben wir zwei optimierte Probenaufbereitungsprotokolle für SF vorgestellt. Ziel dieser Studie war es 1. zu untersuchen ob der häufig verwendete Hyaluronidase-Vorverdau von SF erforderlich ist und 2. ob die optimierten Probenaufbereitungsprotokolle auch den Nachweis von C. tr. persistierend infizierten Zellen in SF ermöglichen. Methodik: Serielle Verdünnungen von C. tr. Elementarkörperchen (EK) in SF wurden mittels 4 verschiedener Methoden aufgereinigt. [1]: Enzymatischer Verdau des SF-Sedimentes mit Hyaluronidase Inkubation in Lyse-Puffer mit Proteinase K 20 min kochen bei 95 °C gefolgt von Phenol/Chloroform DNA Extraktion und Ethanol-Präzipitation. [2]: wie [1] jedoch ohne Hyaluronidase-Vorverdau. [3]: Vorbehandlung mit Proteinase K DNA Extraktion mittels QIAEX Gel extraction kit (Qiagen Hilden). [4]: wie [3] jedoch mit zusätzlichem Hyaluronidase-Vorverdau. 3 verschiedene Verdünnungsreihen wurden nach diesen Methoden aufgereinigt und mittels einer MOMP-Gen-spezifischen PCR untersucht (Kuipers et al. J. Clin. Microbiol 1995 33; 3186). Die beiden einfachsten Methoden die die höchste Sensitivität der PCR erlaubten wurden anschließend eingesetzt um Verdünnungsreihen von C. tr. persistierend infizierten Monozyten aufzureinigen und mittels PCR zu untersuchen. Ergebnisse: Die höchste Sensitivität (0.01 C. tr. EK/ml) wurde erzielt mit Methode [1] gefolgt von Methode [3] (10 EK/ml). Die Zugabe von Hyaluronidase steigerte nicht die Sensitivität von Methode [3] sie war jedoch erforderlich um mittels Methode [1] reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Sowohl mit Methode [1] als auch mit Methode [3] gelang der Nachweis eines einzelnen C. tr. persistierend infizierten Monozyten in der SF-Probe. Schlußfolgerung: Die getesteten Methoden erlauben eine hochsensitive Detektion sowohl von isolierten C. tr. EK als auch von C. tr. persistierend infizierten Monozyten. Der Effekt eines Hyaluronidase-Vorverdaues ist entscheidend von der nachfolgenden Aufreinigungsmethode abhängig. le

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