Die Expression einer c-Raf dominant negativen Mutante inhibiert nicht die Invasion von humanem Knorpel durch RA synoviale Fibroblasten (SF)

Journal/Book: Z Rheumatol 1998; 57 Suppl. 1: 40 (D 4). 1998;

Abstract: 1Zentrum für Experimentelle Rheumatologie 2lnstitut für Medizinische Virologie; Unispital Zürich Man nimmt an daß die Hochregulierung von Proto-Onkogenen im Rahmen der Aktivierung von SF eine wichtige Rolle bei der rheumatoiden Knorpeldestruktion spielt. Ziel der Arbeit war es unter den verschiedenen Aktivierungswegen die Bedeutung der Ras-Raf-MAPK Kaskade zu untersuchen. Dazu exprimierten wir mittels eines retroviralen Vektors eine dominant negative Mutante des c-Raf-1 Gens in RA SF. SF wurden von RA Patienten isoliert die synovektomiert wurden. Die SF wurden mit viralem Überstand der amphotropen Verpackungszellinie GP + env Am12 transduziert die mit einem retroviralen LXSN Konstrukt transfiziert waren. Das Konstrukt umfaßte eine dominant negative c-Raf Mutante die zusätzlich mit einem FLAG Peptid markiert war. Nach Selektion unter G418 im Kulturmedium wurden die transduzierten SF zusammen mit normalem menschlichen Knorpel unter die Nierenkapsel von SCID Mäusen (n = 3) implantiert. Nach 60 Tagen wurde die Invasion in den Knorpel histologisch beurteilt und semiquantitativ nach Invasionsgraden eingeteilt (1 - 4; 0 = keine Invasion 4 = breite Invasionsfront). Die Kontrollgruppen umfaßten RA SF die mit einem "mock" Vektor transduziert waren (n = 4) und parentale nicht-transduzierte RA SF (n = 3). Die in vitro Expression der Mutante wurde in einem Westernblot mit spezifischen Antikörpern gegen das N-terminale Met-FLAG Fusionsprotein verifiziert. Eine deutliche in vitro Expression der c-Raf Mutante konnte in den transduzierten RA SF bis nach 5 Monaten nachgewiesen werden. Die "mock" transduzierten RA SF und die parentalen nicht-transduzierten SF führten zu einer ausgedehnten aktiven Knorpelinvasion (mittlerer Invasionsgrad = 2 9). ... le

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